Co může být problém, pokud se kapely neobjeví v programu Western Blot?

Odpovědět:

Mnoho…

Vysvětlení:

Existuje mnoho důvodů, proč se kapely nemusí objevit na western blotu. Pracovala v minulosti kombinace vzorků a protilátek?

Níže jsou jen některé, na které v tuto chvíli mohu myslet, že mohou způsobit, že se kapely neobjeví:

1. Přenos bílkovin z gelu? Zkuste barvit membránu něčím podobným ponceau S nebo amido black, abyste zjistili, zda jsou kapely přítomny. Někdy můžete vidět proteinové pásy na membráně tak, že je navlhčíte a přidržíte je pod úhlem ke světlu.

2. Pracuje primární protilátka? To je těžké testovat a jediný způsob, jak můžete být, je zahrnutím pozitivní kontroly, kde víte, že máte přítomný protein. Pokud máte nějaký protein, o který se zajímáte, můžete si jej vyzkoušet na membránu Western blotting (tj. Neběžíte gel) a uvidíte, zda se vám podaří dosáhnout výsledku, pokud budete membránu zpracovávat, jako by to byl western blot.

3. Je sekundární protilátka rozpoznávající primární protilátku? Znovu, tvrdý test. O jediné zkoušce, kterou můžete udělat, je bodový test uvedený výše v odstavci 2.

4. Pracuje "detekční systém"? V závislosti na metodě detekce, kterou používáte, se můžete pokusit o zvýšení množství sekundární protilátky, abyste zjistili, zda funguje detekční roztok a také spouštěcí činidlo / enzym na sekundární protilátce. To znamená, že můžete spustit reakci právě se sekundární protilátkou?

Nakonec by to mohlo být tak jednoduché jako jedno z řešení, které bylo použito při nesprávném zjišťování pozemku. Pokud je například koncentrace soli v pufru nesprávná, může to způsobit uvolnění protilátek z blotu. Totéž by se stalo, kdyby pH pufrů bylo nesprávné.

„Nejpodivnější“ příčina, která nefungovala, kterou jsem osobně zažil, byla, když jsme změnili dodavatele sušeného mléka, který jsme použili k blokování membrány. Prášek od nového dodavatele obsahoval fosfotyrosin fosfatázu, která odstranila všechny fosfátové skupiny, které jsme se snažili detekovat pomocí naší anti-fosfotyrosinové protilátky.